探针法qPCR在支原体检测方面的应用

实时荧光探针PCR技术，又称为qPCR，是一种结合了PCR扩增和荧光检测的分子生物学技术。它能够在PCR反应进行的同时，实时监测特定DNA序列的扩增情况。该技术主要依赖于荧光标记的探针，这些探针能够特异性地结合到目标DNA序列上。

在PCR循环中，随着目标DNA的指数级扩增，荧光信号也相应增强。荧光信号的强度与扩增产物的量成正比，因此可以通过荧光信号的变化来实时监测PCR反应的进程。实时荧光探针PCR技术通常使用两种类型的荧光探针：TaqMan探针和SYBR Green。

SYBR Green是一种DNA染料，它能够非特异性地结合到双链DNA上，具有使用简便，价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性，即染料可以与任何dsDNA结合。因此，qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值，影响定量结果的准确性，而TaqMan探针法的出现很好地解决了染料法非特异性的问题，这也让TaqMan探针法在检测领域大放异彩！接下来，就让我们了解一下TaqMan探针法qPCR在支原体检测方面的应用。

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它含有一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在PCR扩增过程中，TaqMan探针与目标DNA序列结合，Taq DNA聚合酶的5'到3'外切酶活性会切割探针，导致报告基团和淬灭基团分离，从而发出荧光信号。切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的。

检测机制与定量分析‌

根据检测方式不同，PCR试剂盒分为‌常规PCR‌和‌实时荧光定量PCR‌两类：

常规PCR检测

扩增后通过琼脂糖凝胶电泳分析产物大小，定性判断目标片段是否存在。

实时荧光定量PCR（qPCR）

荧光标记‌：加入荧光探针（如TaqMan探针）或DNA结合染料（如SYBR Green）；

信号监测‌：每轮扩增后实时检测荧光强度，通过‌t值（荧光达到阈值所需循环数）定量起始模板量；

标准曲线法‌：利用已知浓度的标准品建立Ct值与模板浓度的线性关系，计算样品浓度

探针法qPCR在支原体检测中的应用

引物设计

针对支原体16S rRNA序列，下载后进行序列比对，筛选支原体特异性的区段，寻找两端特异中间保守的区段，设计引物。一般选择多对正反向引物，和多条相对应的探针引物。

内参设计

同时为了保证实验的有效性和稳定性，往往还会设计一对内参引物和内参荧光探针，用于监控每次反应过程的稳定性。

反应模板

检测时需取培养至少2~3天的细胞培养物，进行核酸提取后，作为模板进行qPCR反应。

目前市场上优秀的qPCR支原体检测试剂盒可检测支原体种类可达到39~180种以上，检测灵敏度可达到10cfu/mL。

1高特异性：TaqMan探针通过与目标DNA序列特异性结合，确保了检测的高特异性。

2高灵敏度：该方法可以检测极低浓度的核酸模板，灵敏度高。

3实时监测：在PCR反应过程中实时监测荧光信号，可以准确地定量分析。

4减少污染风险：由于不需要后续处理，减少了PCR产物污染的风险。

多重检测能力：可以同时使用不同颜色的荧光标记，进行多重检测。

5简化操作：制作成预混液后，大大简化操作步骤，易于标准化和自动化。TaqMan探针法qPCR应用于支原体检测的优点